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“基因测序技术的前世今生”

如今，相信大部分人都已经多少了解以及接触过基因检测。基因检测最常见的应用大多集中在疾病监测和健康指导方面，例如通过基因检测了解自己是否有家族性遗传病的致病突变，又如提前预知某个疾病的患病风险，从而为自身的健康管理提供最好的依据等。

基因检测技术的发展，对于促进生命科学的进步，提高全人类的健康水平，有着极其重要的意义。那么在最早定义这一个个基因，并把它们和相关的序列联系起来的时候，生物家到底做出了哪些努力？而基因所蕴含的遗传密码，又究竟是如何被检测出来的呢？

说到这些，我们不得不提起一位在生物界人尽皆知的传奇人物… …

 1. 弗雷德里克·桑格

  （Frederick Sanger） 

而刚刚过去的8月13日，正是桑格这位传奇人物的诞辰日。

1955年，英国生物化学家弗雷德里克·桑格（Frederick Sanger）测定了牛胰岛素的一级结构，确定了胰岛素两条肽链分别含21个和30个氨基酸的排列顺序和位置。该项研究使他独享1958年的诺贝尔化学奖。

1975年時，桑格发明出一种称为链终止法（chain termination method）的技术来测定DNA序列，这种方法也称作「双脱氧终止法」（Dideoxy termination method）或是「桑格法」，至今，这仍是基因测序界无可撼动的黄金标准。

1977年，他利用此项技术测定出Φ-X174型噬菌体的基因组序列，这也是人类历史上首次完整的基因组测序工作。

因此，桑格凭借着双脱氧终止法测序技术的应用，与发明化学降解测序法的沃特·吉尔伯特（Walter Gilbert），以及构建第一个重组DNA分子的保罗·伯格（Paul Berg）共同荣获了1980年诺贝尔化学奖。

桑格法的原理为核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就随机停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。如此每管反应体系中便合成以共同引物为5’端，以双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分四个泳道进行电泳。以分离长短不一的核酸片段（长度相邻者仅差一个碱基），根据片段3’端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。

 2. 第一代测序技术时代

     ——Sanger链终止法

以 ABI（Applied Biosystems Inc.）公司[1]研发的ABI 377测序仪为代表，20世纪 80年代末，科学家们开始用荧光标记的测序技术取代同位素标记测序，四色荧光标记的应用使测序反应物的分离能在一个变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的泳道完成，从而降低了泳道间迁移率差异对测序精度的影响，这为一块平板胶做96个样品的高密度电泳的发展奠定了基础。

为了获得更高通量，20世纪90年代，科学家们开始使用毛细管列阵电泳取代聚丙烯酰胺凝胶平板电泳，使样本分离可在一系列平行的毛细管内进行，可同时并行分析多个样本，进一步加快了DNA的测序速度。

这一过程，使得测序技术从平板胶电泳测序（Gel Electrophoresis）到毛细管电泳测序（Capillary Electrophoresis）产生了质的飞跃。

图1： ABI公司测序仪器的发展

 3. 第二代测序技术时代

     ——高通量基因测序

2001年，随着人类基因组计划的完成，人们进入了功能基因组时代，深度测序和重复测序等大规模基因组测序日益增多。第一代测序方法已经不能满足这些需求，科学家们开始寻求新的测序方法。第二代测序技术，即大规模平行测序技术应运而生。这不仅将DNA测序费用降到了以前的百分之一，并且由于其高通量的特征，使得对一个物种的基因组和转录组测序变得方便易行。让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的“特权”能够被众多研究人员分享。在此过程中，市场上涌现出了很多第二代测序仪产品，例如罗氏公司的454、Life Technologies公司的SOLiD, PGM、 Illumina公司HiSeq等测序仪。其中，属Illumina公司的二代测序仪最具代表性，首屈一指的高通量技术使该公司占据最大市场份额。

      图2：Illumina测序仪的发展史

 4. 测序价格发展趋势

据NIH数据统计，2001年，全基因组测序需要耗资高达一亿美元；2011年，第二代测序技术成功推出后全基因组测序价格已下降至1万美元；2014年，随着Illumina X Ten的成功上市又再次将价格大幅度缩减至1千美元，而2017年1月，在JP摩根健康大会上，IIIumina NovaSeq 6000的上市更是在如今百舸争流的基因测序市场脱颖而出，Illumina 的总裁这样说道：“推出 NovaSeq 是 Illumina 创新历史上的一个最重要的拐点。就如同我们在2014年首次发布 HiSeq X 时，该仪器通过 HiSeq? 架构将每个基因组的成本降至1000美元一样，我们相信未来从今日发布的 NovaSeq 架构发展而来的系统总有一天会将单个基因组的价格降至100美元。”

      图3：NIH数据，2001年-2015年全基因组测序价格变化